Humán dendritikus sejtek működésének szabályozása komplementfehérjék és receptoraik által; exosomák jelentősége a T-sejt válasz kialakításában = Regulation of the function of dendritic cells by complement proteins and receptors; the role of exosomes in the development of T-cell response

A dendritikus sejtek (DC-k) érését számos stimulus indukálja, mint például a gyulladásos körülmények vagy mikrobiális termékek jelenléte. A szervezetbe kerülő antigén a komplementrendszer aktiválódása következtében opszonizált formában van jelen, ami az antigén különböző koplementreceptort hordozó immunsejtekhez való kötődéséhez vezet. Munkánk során a C1q és C3 komplementfehérje hatását tanulmányoztuk humán DC-k fenotípusára és funkcionális aktivitására. A monocita eredetű éretlen DC-k (MDC-k) differenciálódását sejfelszíni molekuláik expresszió vizsgálatával követtük nyomon. Az immobilizált C1q jelenlétében inkubált DC-kben fokozódott az NF-?B transzlokációja. Az C1q-val aktivált MDC-k Th1 típusú immunválaszt indukáltak. A natív, hemolitikusan aktív C3-al kezelt MDC-k képesek kovalensen fixálni felszínükön a C3 fragmentumokat és ez kiváltja a sejtek érését. A kovalensen kötött C3-fragmentumok kitűntetett szerepét támasztják alá CD11b (CR3 alfa lánc) géncsendesítési kísérleteink is. Az általunk tanulmányozott folyamatok in vivo jelentőségét kívántuk vizsgálni gyulladásos szituációban azokban a kísérleteinkben, amelyekben a DC-ket C3-at termelő aktivált makrofágok jelenlétében tenyésztettük. Ezekben a kokultúrákban a DC-k sejtmembránjukon fixálták a makrofágok által szekretált C3 nagy részét. Eredményeink meggyőzően bizonyítják, hogy az antigénbemutató sejtek, a környezetükben jelenlévő komplementfehérjék hatására, T limfociták aktiválására alkalmas sejtekké érnek. | Maturation of dendritic cells (DCs) is known to be induced by several stimuli, including microbial products or inflammatory stimuli. As a consequence of these in vivo occurring events, antigens opsonized by various complement proteins may bind to several cell types expressing complement receptors. We investigated how complement C1q and C3 influence the phenotype and functional activity of human DCs. Immobilized C1q induced maturation of MDCs, enhanced NF-KB translocation. Our data suggest that C1q-induced DC maturation generates a Th1-type response. We found that MDCs incubated with native, hemolytically active C3, can bind the activation fragments of C3 covalently. This reaction directs MDCs to induce maturation. A further functional consequence of C3b fixation was the elevated capacity of the DCs to stimulate allogenic T cells. The distinct role of covalently fixed C3-fragments is strongly supported by our results obtained with MDCs where CD11b (CR3 alfa chain) expression was downregulated by siRNA. To reveal the possible in vivo significance of the present findings we modelled a phenomenon occuring during inflammation, where C3 is produced locally by activated macrophages. In these cocultures MDCs were found to fix substantial amounts of macrophage derived C3-fragments on their cell membrane. Our data provide compelling evidence that antigenpresenting cells arising in complement-sufficient environment mature to competent stimulators of T cells

Mannóz-kötő lektin és C1q szerepe dendritikus sejtek és makrofágok funkcióiban és immunregulációs folyamatokban = The role of mannose binding lectin (MBL) and Clq on various functions of dendritic cells and macrophages and on immunoregulation

Munkánk célja annak kiderítése volt, hogy az in vivo körülmények között IC-hez kapcsolódó C1q és MBL komplement fehérjék befolyásolják-e a dendritikus sejtek (DC-k) működését. A C1q-t erősen kötötték a sejtek, viszont az MBL nem kötődött A sejteket C1q-val fedett felszínen tenyésztettük, az C1q-val borított antigén felszínt modellezve ilyen módon. Az immobilizált C1q erősen stimulálta az MDC-k érését, amit a CD83, CD86 és MHCII membránfehérjék expresszió fokozódása jelzett. Ezeknek a molekuláknak az expressziója megközelítette az LPS által indukált mértéket. Kimutattuk, hogy az immobilizált C1q-val aktivált MDC-k fokozott allogén T-sejt proliferációt váltanak ki. A fokozás mértéke hasonló volt az LPS-kezelt MDC által kiváltott hatáshoz. Igazoltuk, hogy a C1q kötődése MDC-khez az NF-kB transzkripciós faktor magi transzlokációját váltja ki, és fokozott IL-12, IL-6, TNF-alfa és IL-10 szekréciót okoz. Kimutattuk, hogy az immobilizált C1q Th1 típusú választ indukál, mivel a C1q-aktivált MDC-k kokultúrában IFN-gamma termelő allogén T-sejteket stimulálnak. Jelen munkánkban bizonyítottuk, hogy az MDC-khez kötődő C1q képes fokozni az adaptív immunválaszt, ugyanakkor T-sejt toleranciát is indukálhat, az adott szöveti környezett által meghatározott módon. | The aim of our present study was to investigate whether additional components known to be associated with immune complexes (ICs);C1q and MBL formed in vivo also influence dendritic cell (DC) maturation. Monocyte derived DCs (MDC) strongly bind C1q but they do not interact with MBL. MDCs were cultured on immobilized C1q, in order to mimick the multimeric configuration presented on ICs. Cultivating of imMDCs on immobilized C1q leads to enhanced expression of CD83, CD86 and MHCII, almost to the same extent as in the presence of LPS. Our results also demonstrate that MDCs matured on immobilized C1q activate allogeneic T-cells to a similar extent as LPS-matured cells, pointing to a novel role for C1q and emphasizing the biological relevance of these findings in vivo. C1q binding causes NF-kB translocation to the nucleus in imMDCs, and that cultivating imMDCs on immobilized C1q results in elevated production of IL-12, IL-6 TNF-alfa and IL-10. We demonstrated that immobilized C1q directs a Th1 response, since allogeneic T cells co-cultured with C1q-matured DCs are IFN-gamma producers. In the present study we demonstrate that in addition to IgG, another serum protein, C1q, is also a potent maturation factor, which can induce phenotypic and functional changes in MDCs. Our data suggest that C1q could be a major signal for DCs to induce either an enhanced adaptive immune response or T cell tolerance, depending on their tissue environment

Az adaptív immunválasz kialakulása és szabályozása fiziológiás és kóros körülmények között: dendritikus sejtek, hízósejtek és a komplementrendszer szerepének vizsgálata = Regulation of adaptive immune responses under normal and pathological conditions; role of dendritic cells, mastocytes and the complement system

A magasabbrendű szervezetek immunhomeosztázisát a veleszületett és az adaptív immunrendszer együtt tartja fenn; egymással szorosan összefonódva, folyamatosan együttműködve. E két rendszer sejtes és molekuláris elemei - köztük a limfociták, makrofágok, dendritikus sejtek, hízósejtek, továbbá a komplementrendszer és a különböző citokinek - számos ponton hatnak egymásra úgy a fiziológiás, mint a kóros immunfolyamatok esetében. A pályázati munka során újabb kölcsönhatásokat írtunk le e két rendszer között, megismertük az egyes folyamatok molekuláris mechanizmusát, és a veleszületett immunrendszer egyes elemeink számos új funkcióját tártuk fel. Mindezzel jelentősen hozzájárultunk a veleszületett elemek adaptív választ befolyásoló ill. irányító hatásának további megismeréséhez. A pályázati munkába hét doktoranduszt vontunk be, akik közül öten már megszerezték a PhD fokozatot. Eredményeinket tizenkét, nemzetközi szaklapban megjelent publikációban közöltük; a cikkek - IF: 49.5. | The immunehomeostasis of higher vertebrates is maintained by the constant coordination and cooperation of the elements of the innate and adaptive immune system. Their cellular and molecular constituents - such as lymphocytes, macrophages, dendritic cells, mast cells, and the complement system and various cytokines - exert their effect on each other at several points under both physiological and pathological conditions. During the period of this research grant we could get further insight into the molecular mechanisms of these interactions; we learnt more about the possible ways how innate elements may influence or direct adaptive responses, moreover, we revealed some novel functions of certain elements. Seven doctoral students have been involved in this research - five of them already defended their thesis. 12 papers have been published in peer-reviewed journals; 'IF: 49.5

Characterization of factors influencing on-chip complement activation to optimize parallel measurement of antibody and complement proteins on antigen microarrays.

Binding of immunoglobulins and complement fragments to targets of adaptive immune responses can be monitored using collections of arrayed antigens and is used to generate profiles of antibody binding and function. The collection of reliable data on these reactions on a large scale requires the establishment of criteria from sample collection through reaction conditions to normalization strategies. We characterized the detection of IgG, complement C3 and C4 under conditions that better resemble in vivo events than most serological assays and are also relevant for in vitro diagnostic purposes. Immune complex formation was modeled using nitrocellulose-based protein arrays and the effects of factors like anticoagulant use, serum dilution, time and bivalent cation concentrations were assessed. Blood samples from healthy controls (n=24) and patients with systemic autoimmune disease (n=60) were collected and correlations between classical laboratory tests and chip-based reference proteins were evaluated to optimize normalization schemes. Best signal-to-noise ratio and acceptable masking of IgG by complement C3 fragments was achieved at modest, five to ten-fold serum dilutions. C3 binding to captured human IgG was found to correlate best with serum C3 concentrations and C3 activity and is therefore an ideal reference feature for normalization of biological and methodological variations in complement activity and detection

A komplementrendszer immunfunkciókat szabályozó szerepe fiziológiás és kóros folyamatok során = Immunoregulatory role of complement under physiological and pathological conditions

A komplementrendszer immunvédekezésünk szerves része. A legnagyobb mennyiségben előforduló komponens, a C3 szerepe igen változatos; a patogének eliminálásától az immunválasz szabályozásáig terjed. A számos biológiai funkciót főként a C3 aktivációs fragmentumai közvetítik, amelyek különböző sejtek különböző komplementreceptoraihoz kötődnek. Célunk az volt, hogy a C3 újabb, immunfolyamatokat szabályozó szerepét feltárjuk. Kísérleteink eredményei eddig nem ismert molekuláris és sejtes mechanizmusokra derítettek fényt, egyrészt a limfociták CR1 által közvetített gátlásának további tanulmányozásával, másrészt az antigénbemutató sejtek funkcióival kapcsolatban. Vizsgálataink során autoimmun betegek (RA és SLE) sejtjeit is vizsgáltuk, valamint az SM egér-modelljét, az EAE-t is tanulmányoztuk. Eredményeink nemcsak azért fontosak, mert általuk jobban megértjük az alapvető immunfolyamatokat, hanem azért is, mert egyes autoimmun-betegségek kezelésében reménykeltő cél-molekulát sikerült azonosítanunk. Eredményeinket számos ""peer-reviewed"" cikkben közöltük (össz-IF: 66), továbbá a projekt anyagából két PhD-fokozat született és további kettő folyamatban van. Eredményeink arra sarkalltak, hogy kutatásainkat kiterjesszük a munkatervben nem részletezett területre is, melynek során Dr. Prechl Józseffel és Dr. Papp Krisztiánnal (MTA-ELTE Immunológiai Kutatócsoport) együttműködve mikro-array rendszert dolgoztunk ki az ellenanyag (köztük autoantitestek) általi komplementaktiválás kimutatására. | The complement system is an integral part of our immune system. The role of its most abundant protein, component C3, is very versatile – it ranges from the elimination of pathogens to the regulation of immune responses. The various biological functions are mainly mediated by the activation fragments of C3, via their interaction with different complement receptors expressed by different cell types. Our goal was to reveal new regulatory functions of C3. We have described so far unknown molecular and cellular interactions, further analysed the CR1-mediated inhibiton of lymphocyte functions and the role of C3 in the function of antigenpresenting cells. We extended our studies to autoimmune patients – such as RA and SLE -, furthermore to EAE, the mouse modell of SM. Our results are important not only beacuse they help better understand basic immunological processes, but also because we could identify a promising target-molecule for the treatment of autoimmune disorders. We published our results in peer-reviewed international journals (total IF: 66), furthermore two PhD-degrees were accomplished and further two will be obtained based on this OTKA-project. Our results urged us to extend the research to a new area, namely the development of a protein-microarray system, which can be used to detect complement activation initiated by antibodies. This work was accomplished by a cooperation with Drs. J.Prechl and K.Papp at the Immunology Research Group of the HAS at ELU

Cellular response to efficient dUTPase RNAi silencing in stable HeLa cell lines perturbs expression levels of genes involved in thymidylate metabolism.

dUTPase is involved in preserving DNA integrity in cells. We report an efficient dUTPase silencing by RNAi-based system in stable human cell line. Repression of dUTPase induced specific expression level increments for thymidylate kinase and thymidine kinase, and also an increased sensitization to 5-fluoro-2'-deoxyuridine and 5-fluoro-uracil. The catalytic mechanism of dUTPase was investigated for 5-fluoro-dUTP. The 5F-substitution on the uracil ring of the substrate did not change the kinetic mechanism of dUTP hydrolysis by dUTPase. Results indicate that RNAi silencing of dUTPase induces a complex cellular response wherein sensitivity towards fluoropyrimidines and gene expression levels of related enzymes are both modulated